Algum tempo depois, Paulo disse a Barnabé: Vamos visitar de novo os irmãos em todas as cidades onde pregamos a Palavra do Senhor e ver como vão. (Atos 15:36) A segunda jornada começou em circunstâncias muito infelizes: Barnabé queria levar João, também chamado Marcos, com eles, mas Paulo não achava prudente levá-lo, porque ele os havia abandonado na Panfília e não continuou com eles na palavra. Eles tiveram um tal diferendo que eles se separaram. Barnabé, levando consigo Marcos, navegou para Chipre, mas Paulo escolheu Silas e partiu. (Atos 15:37-40) O motivo da discussão foi que, durante a Primeira viagem missionária de Paulo, uma marca negativa deixada pelo jovem João Marcos abandonou-os no inicio da viagem e voltou para casa. Apesar de Paulo e Barnabé aparentemente nunca viajarem juntos de novo, não havia nenhuma animosidade duradoura entre eles - Paulo mais tarde falou muito bem de Barnabé. Paulo também o fez de Marcos, que mais tarde foi com ele durante a prisão de Paulo em Roma (Colossenses 4:10, 2 Timóteo 4:11). A Segunda viagem missionária de Paulo começou por volta do ano 49 dC, e como a primeira viagem, não era uma excursão de 10 dias. Ele só voltaria cerca de 3 anos mais tarde, ou seja, por volta do ano 52 dC. A jornada anterior começou navegando para Chipre, mas desta vez, ele partiu por terra através da Síria e Cilícia, a revisitar as igrejas que haviam anteriormente sido estabelecidas na Ásia, incluindo aquelas em Derbe, Listra e, de onde levou com ele a Timóteo (Atos 16:01 -5). De lá, eles continuaram em direção ao norte através da Frígia e Galácia (Atos 16:6). Paulo permaneceu na Galácia durante algum tempo devido a uma doença não especificada (Gálatas 4:13-14). De Galácia, Paulo tinha a intenção de viajar para nordeste através de Bitínia, uma região na costa do Mar Negro, no entanto eles tentaram entrar na Bitínia, mas o Espírito de Jesus não lhes permitiria. Então, eles passaram pela Mísia e desceram para Troade. (Atos 16:7-8). Troade fica na costa do Mar Egeu. O próprio Jesus Cristo estava dirigindo Paulo para o oeste da Ásia, onde Paulo tinha a intenção de permanecer, para chegar até à Grécia. Paulo levou o Evangelho por toda a Europa.